16 февраля, 2021

ПЦР-диагностика

В 2020 году лечебные организации г.Пинска получили возможность использовать новый для нас метод диагностики – полимеразную цепную реакцию. Суть этого метода заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в специально разработанном аппарате.

Последовательность нуклеиновых кислот кодирует строение белков, а также исполняет регуляторные функции. Каждый вид живого организма имеет участки в своей ДНК, характерные только для него. В процессе полимеразной цепной реакции и происходит выявление таких участков.

Современный вариант полимеразной цепной реакции – ПЦР реального времени – состоит из двух этапов:

  1. Выделение ДНК/РНК из исследуемого материала. Синтез ДНК из РНК, если искомый инфекционный агент содержит лишь РНК (ВИЧ, гепатит «С», COVID-19).
  2. Выявление начилия характерного участка ДНК путем синтеза новых молекул с использованием небольших цепочек – праймеров.

Выделение ДНК/РНК проводится с использованием лизирующих растворов, которые разрушают клеточные, вирусные оболочки. После этого ДНК или РНК адсорбируется на твердой поверхности специального порошка. Порошок осаждается, а жидкость, содержащая компоненты клеток удаляется. После промывки и удаления промывной жидкости добавляется раствор, приводящий к отслаиванию ДНК или РНК от адсорбирующего порошка.

Далее при определении микроорганизмов содержащих РНК производится синтез из РНК – ДНК с применением специального фермента.

Последний этап – цикличное нагревание / охлаждение в присутствии ферментов (Taq-полимераза) и нуклеиновых кислот. В результате нагревания происходит разделение ДНК на две нити, после охлаждения ДНК либо восстанавливает свою двухнитиевую структуру, либо, при наличии участка вирусной ДНК, к нему присоединяется праймер – характерная для вируса последовательность длиной 10-20 нуклеиновых кислот, на основе которой ферментом достраивается остальная нить ДНК. При этом от праймера отделяется белок, вызывающий флюоресценцию (свечение), улавливаемую датчиками амплификатора. В каждом цикле нагрева/охлаждения в случае наличия вируса количество ДНК удваивается. Вначале свечение так мало, что прибор не может его уловить, но через 15-20 циклов количество ДНК уже увеличивается настолько, что свечение можно видеть. К 21-му циклу из одной молекулы ДНК получаем больше миллиона молекул, к 31-му – более миллиарда.

Теоретически ПЦР позволяет выявить инфекционный агент при получении лишь одной копии искомой ДНК. Кроме того, выявить инфекцию можно в первые часы заболевания, когда еще человек не чувствует себя больным, а другие методы дают отрицательный результат.

Положительный результат ПЦР возможен лишь при выявлении ДНК возбудителя инфекционного заболевания, посторонние примеси не дадут положительный результат, это высокоспецифичный метод исследования.

Учитывая эпидемиологическую обстановку первые анализы методом ПЦР в Пинске были на коронавирусную инфекцию COVID-19. Метод показал себя как чувствительный, специфичный и достаточно оперативно работающий.

С декабря 2020 года только в лаборатории станции переливания крови, где проводились исследования для Столинского района, было сделано 4197 анализов. Получено 1590 положительных результатов. Особенно радует наметившаяся тенденция по снижению заболеваемости.

В ближайшее время метод будет применяться при обследовании донорской крови на вирусные инфекции (ВИЧ, гепатиты), а также в других клинически оправданных случаях.

 

Заведующий лабораторией

трансфузионно-трансмиссивных инфекций                              Шапоров С.Н.